说到荧光定量PCR仪，面对一堆名词，一头雾水。扩增曲线、标准曲线、域值、CT值、熔解曲 线、基线到底都是什么意思？PCR荧光图不认识？今天带大家一起学习一下。

PCR所涉及的名词解释

扩增曲线：

扩增曲线是指PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。

基线（Baseline）：

基线是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。

荧光域值（threshold）的设定：

一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。一般来说，每台仪器在使用前都已经设置好了荧光阈值。

CT值：

CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：

A：曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

B：曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。

C：标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。

D：各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。

熔解曲线：

对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时（Tm），会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。

熔解曲线（取对数曲线）：

对熔解曲线取对数，形成峰图，更直观的显示产物片段的情况。由于熔解温度即是该DNA片段的Tm值，以此可以判断影响DNA片段Tm值的一些参数，比如片段大小、GC含量等等。一般来说，根据我们的引物设计原则，扩增产物长度在80-300bp范围，那么熔解温度应该是在80℃-90℃之间。

A：如果在80℃-90℃之间出现唯一主峰，说明荧光定量PCR完美；

B：如果在80℃-90℃之间出现主峰，80℃以下出现杂峰，基本考虑引物二聚体，可尝试提高退火温度解决；

C：如果在80℃-90℃之间出现主峰，温度上升又出现杂峰，基本上考虑有DNA污染，需要在实验初始阶段去除DNA。

标准曲线：

将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值作为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样本的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。标准曲线在绝对定量的时候非常重要。

PCR仪常见问题解答

Q：RT-PCR、QPCR、Real-time PCR、real-time RT-PCR有什么区别？

A：RT-PCR就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。

Real-time-PCR和 qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。

虽然Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和 Reverse transcription PCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）。

而real-time RT-PCR（RT-qPCR）， 就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从 RNA 反转录得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。

Q：为什么荧光定量PCR的扩增产物片段长度应该控制在80-300bp范围内？

A：每个基因序列长短不一，有的好几kb，有的几百bp，但是我们在设计引物的时候只需要要求产物长度80-300bp，太短或者太长都不适合做荧光定量PCR检测。

产物片段太短，无法跟引物二聚体区分，引物二聚体的长度大概在30-40bp，小于80bp很难区分是引物二聚体还是产物。产物片段太长，超过300bp，容易致使扩增效率低下，不能有效的检测出该基因的量。

打个比方，你在数一间教室里面有多少个人 的时候，只需要数一下有几张嘴就可以了，在检测基因的时候也是一样的，只需要检测某个基因的某一段序列来代表整个序列即可。如果你为了想数多少个人，既要数多少张嘴也要数多少个鼻子、耳朵、眼镜，反而容易数错。

Q：引物设计最佳长度是多少？

A：一般来说，引物长度大概在20-24bp范围是比较好的。当然我们在设计引物的时候一定要注意引物的TM值，因为这个关系到最佳退火温度。经过大量的实验证明，60℃是一个比较好的TM值。退火温度太低容易导致非特异性扩增，退火温度太高一般会导致扩增效率比较低，扩增曲线起峰比较晚，CT值延后。

Q：采集样本量的多少会不会影响实验结果？

A：不会。很明显，采集样本量多，提取的RNA就比较多，cDNA就比较多， 目的片段就比较多。对于绝对定量，要计算出某个目的片段的拷贝数，那么采集样本量的多少肯定会影响实验结果。比如检测血液里面的乙肝病毒HBV，就是检测出一定量（1ml）血液里面的HBV含量。

对于科研工作中常用的相对定量，样本量的多少与实验结果无关，因为相对定量是指目的基因和内参基因相比较，你可以认为它们是存在于同一核酸链条的上下游片段，如果样本量多了，内参基因和目的基因都同时等比例增加，不影响结果。

Q：反转录酶效率高低会不会影响实验结果？

A：同上。此处必须注意，我们希望获得较高的反转录效率，更希望反转录酶的反转录效率比较稳定，得到均一性的结果。这就要考验各大公司对于反转录试剂盒的优化能力了。

Q：Taq酶的效率会不会影响实验结果？

A：Taq酶的效率影响比较大，一般要求用热启动Taq酶，且效率要比较高才行，商品化的荧光定量试剂盒，每个厂家都会在自己的产品的基础上，把效率优化到最好的状态，接近于100%，效率太低实验结果不可用。对于不同公司的产品，这是衡量优劣的指标。

Q：荧光染料的多少会不会影响实验结果？

A：当然是有影响的。荧光染料过于饱和，会导致某些仪器出现噪点干扰；荧光染料不饱和，荧光值太低，导致提前进入平台期，扩增曲线平缓。在荧光定量实验中主要看CT值，因此后期扩增曲线进入平台期显得不那么重要，只是图形不够美观罢了，如果二者必选其一的话，宁愿选择荧光染料略微不饱和。在使用同一公司的同一款产品时，该影响基本可以忽略。

Q：PCR管的透光度会不会影响实验结果？

A：当然是有影响的。但是对于同一厂家同一批耗材，这种影响可以忽略。推荐大家用96孔板加高透膜，使耗材的透光度影响降到最低。

Q：操作过程中的误差会不会影响？

A：操作过程的影响，主要体现在均一性上。均一性是指体系内的所有组分均匀的混合在一起，瞬时离心可以解决均一性问题。另外，对于生手来说，最好调整PCR体系在20ul以上，过小的体系更容易产生误差。再请看下图：如果退火温度优化得合适，引物浓度对CT的影响会降到最低。你会明白，有的操作误差（比如引物浓度）是可以通过优化退火温度来避免的。

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